聊点学术

前面写过4期荧光共定位定量分析的文章，有一些小伙伴整理数据时正好用上了。非常开心能够帮到你们。（没有看过的可点击下方链接回顾）

【操作篇】荧光共定位的定量分析！

【分析篇】荧光共定位的散点图解析！

【拆解篇】荧光共定位定量分析の单通道散点图

【组图篇】如何汇报荧光共定位定量分析结果？？

大家在操作时遇到一个典型问题。就是同样的操作下，为什么不能得到我举例的这种散点图？

（完美的共定位散点图）

这其实是圈选AOI(感兴趣的区域）的问题。个人认为有必要补写一期，探讨其中的原因，帮助大家科学优化实验结果。

▼ 1. 什么是AOI？

AOI即一张图像上你感兴趣或关注的区域。言外之意，就是在图像在定量分析时，非AOI区域没有必要纳入甚至有时必须排除在外，今天要说的就是后面这种情况。

有时我们不去强调AOI，是因为我们的测量指标不会受到影响。例如测量下图中的红色圆形总面积时，不用理会图形B的存在，直接用吸管工具选红色测量即可，无需做AOI处理。

但是，如果要测量图形B中存在多少红色面积，此时必须圈选AOI，Image Pro Plus才会在测量时只关注黄色区域的情况，否则软件会默认分析全图。

我今天要说的荧光共定位就是这样，如果没有对AOI进行圈选，那么IPP共定位定量分析结果会有天壤之别。

▼ 2. 圈选AOI的重要性

请看下图，还记得这个例子吧。假如我只对中间这个细胞的共定位感兴趣，对旁边的两个细胞没有兴趣。

（荧光共定位图）

正确的做法是先用AOI工具选择目标区域，然后再对该区域做荧光共定位分析。直接用全图进行荧光共定位分析，最终结果会有很大差别。这是大家最容易犯的错误。

▼ 3. 什么时候必须圈选AOI？

（1）最典型的就是图像上存在很多元素，但是你感兴趣的地方只存在于小范围内，而不是整张图都存在。此时必须圈选AOI。

(黄色代表共定位区域，蓝色代表细胞核）

圈选AOI的方法如下。矩形代表矩形AOI，圆形代表圆形AOI，腰子型代表手动勾勒AOI（最常用）。操作方法是左键勾勒，勾勒好之后单击右键结束，如果觉得不满意，则点击NEW AOI，然后重新圈选。

圈选AOI原则：必须包含所有的共定位区域，尽可能地排除非共定位区域。

（2）图像不同区域的自发背景荧光分布不均衡时，必须精细圈选AOI，操作同上。这种情况下还需要注意，在圈选之前必须对荧光图像做背景校正，使得我们在AOI和分析之前能够尽可能地得到均一化背景的图像。

荧光图像背景校正：共定位荧光分析的本质是对不同通道的灰度值进行线性回归分析。既然是灰度值分析，直接调用Process下方的背景校正即可。

PS：

写本文时衍生出一个新的问题，不同类型的图像如何做背景校正？如果对此问题感兴趣，可以在下方讨论中留言。

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